本期《精准前沿》栏目分享香港中文大学医学院于君教授研究团队发表于Gastroenterology（IF=33.88）上的一篇研究[1]，研究通过对来自不同国家人群的1329例粪便样本的宏基因组分析，揭示了包括Aspergillus rambellii在内的真菌可作为结直肠癌（CRC）诊断的生物标志物。此外，CRC患者肠道内真菌-真菌、真菌-细菌相互作用明显增强，且与CRC病程呈正相关；联合使用真菌与细菌的生物标志物可在临床上更准确地诊断CRC。

　　

　　研究背景

　　结直肠癌（CRC）是全世界第三大常见癌症，每年造成的死亡病例>500,000例。肠道菌群对CRC进展的影响已被广泛认可，在结直肠癌发生的各个阶段构成成分不断变化，并伴随着致病菌的富集。相比之下，肠道细菌以外的微生物组分，如真菌，在结直肠癌中发挥的作用仍不清楚。近期已有研究揭示共生真菌与不同疾病发病机制的生态学联系，例如真菌菌群通过调节宿主免疫对胰腺癌肿瘤发生的影响，提示肠道真菌失调在癌症发生和发展中的重要作用。

　　研究设计

　　1. 研究队列信息：本研究收集已发表的7篇文章中粪便宏基因组数据集，此外还招募了一个独立的中国队列，共计1329例粪便宏基因组样本（包括454例CRC患者、350例腺瘤患者和525例健康受试者）； 2. CRC患者和健康受试者的真菌丰度差异分析；

　　3. 体外和CRC异种移植小鼠模型验证Aspergillus rambellii对结直肠癌发生的影响；

　　4. 评估肠道真菌-真菌、真菌-细菌相互作用与CRC进展的关联。

　　

　　研究结果

　　1. 对纳入的1329名受试者进行CRC进展相关的肠道菌群meta分析

　　在本文的meta分析中，共纳入7篇已发表的研究结果，这些研究利用鸟枪法对CRC患者和健康受试者的粪便微生物进行宏基因组测序。同时还建立一个内部粪便宏基因组数据集作为额外的研究人群。在这些宏基因组测序结果中，比对到真菌基因组的reads数占总测序reads数的中位数为0.16%（10-2.80） (图1A)。稀疏曲线显示，所有队列样本在真菌测序reads数为10,000时达到平台状态（图1B）。为了保证样本质量，采用一系列严格的过滤标准去除污染样本或真菌含量低的样本（图1C）。过滤后，1329个宏基因组样本被保留，包括454名健康受试者（占健康宏基因组总数的68%），350名腺瘤患者（占腺瘤宏基因组总数的73%）和525名CRC患者（占CRC宏基因组总数的68%）（图1D）。

　　

　　图1. 宏基因组测序数据概况和病例过滤标准

　　2. 肠道菌群在CRC进展中发生改变

　　首先研究了门水平的真菌组成。子囊菌门（Ascomycota）是包括CRC患者和健康受试者在内的所有队列中最常见的真菌门。随后本文比较了CRC患者和健康受试者中前5个门的丰度，发现在所有队列中这些门的丰度变化都不一致。对于真菌丰富度，本文发现将所有队列组合在一起时，CRC患者的α多样性（Chao1 index）与健康受试者相比显著降低（P<0.05），这与之前的报告一致。主成分分析结果表明，各队列间真菌群落的变化显著归因于人群（大陆或性别）和疾病阶段（CRC、腺瘤或健康）的差异，与之前的研究结论一致。体重指数（BMI）和肿瘤位置对真菌群落的变化没有显著影响。

　　3. 确定CRC和腺瘤的标志性真菌物种

　　为了表征CRC相关真菌，比较CRC患者和健康受试者中所有相对丰度>0.1%的真菌物种（n=296）。当FDR<0.1时，有74种差异丰度真菌物种；当FDR<0.01时，上述的74种差异丰度真菌物种缩减至33种（下文称为“真菌核心组”）（图2A）。真菌核心组包含与CRC相关的不同丰度的物种，其中A rambelli的丰度最高，A kawachii的丰度最低（图2B）。每种真菌的丰度变化在不同队列间差异很大，表明队列间存在差异（图2C）。

　　

　　图2. 多队列分析报道一组肠道真菌与CRC具有强相关性

　　真菌核心组包括10种CRC富集真菌和23种CRC减少真菌（图3A）。与健康受试者相比，观察到CRC患者中A rambellii的丰度增加了3.0倍，A kawachii的丰度减少2.0倍（P<0.001）（图3B）。与健康受试者相比，CRC患者中A rambelli的中位丰度更高，在8个研究队列中的7个队列观察到这种持续显著增加（图3C）。

　　

　　图3. CRC患者和健康受试者的特征真菌物种比较

　　4. Aspergillus rambellii在体外和异种移植小鼠模型中均促进CRC

　　为了验证生信分析结果，2个CRC细胞系，SW480和HT29以及正常结肠上皮细胞系NCM460与A.r CM或对照培养基SDB共培养。A.r CM显著增加CRC和正常上皮细胞的活力（SW480和NCM460, P<0.01;HT29, P<0.001）（图4A）。A.r CM也明显促进肿瘤细胞集落形成（SW480和HT29, P<0.001）（图4B）。然后作者将2种来源自CRC患者的类器官与A.r CM或SDB对照共培养。A.r CM处理后，CRC类器官的生长和增殖均显著增强（图4C）。

　　然后使用植入CRC细胞系SW480的皮下异种移植小鼠模型评估A rambelllii在体内是否具有致癌作用。瘤内注射A rambellii或PBS作为对照，作者发现与PBS对照组相比，A rambelllii显著促进肿瘤生长（P<0.05）（图4D）和肿瘤重量（P<0.05）（图4E）。与对照组小鼠肿瘤组织相比，A rambelllii也显著促进肿瘤组织细胞增殖，表现为Ki-67阳性细胞比例升高（P<0.001）（图4F），以及增殖细胞核抗原的蛋白水平增加（P<0.0001）（图4G）。因此，体外和体内研究结果一致表明A rambellii可以促进CRC进展。

　　

　　图4. Aspergillus rambelli在体外和体内促进结直肠肿瘤的发生

　　5. CRC进展中的真菌-真菌和真菌-细菌相互作用

　　已有研究表明CRC进展中存在微生物之间的相互作用。因此，作者分别在CRC患者、腺瘤患者和健康受试者中评估了真菌核心组的33种真菌之间的相互作用。真菌间的共发生和共排斥相互作用在不同受试者组间均存在显著差异，且真菌-真菌相互作用对CRC的影响逐渐增强（图5A）。在CRC中，4种CRC富集真菌，包括A rambellii、E pulchra、T punctulata和S musiva，显示出显著的共现中心性。这些共发生的相关性在腺瘤患者中较弱，而在健康受试者中消失。与CRC患者相比，A rambellii在腺瘤患者和健康受试者中与其他真菌的相互作用完全不同，其中仅与M perniciosa表现出强相关性。本文的结果确定了关键真菌，特别是A rambellii，在CRC进展的肠道菌群中发挥核心作用。

　　鉴于人类肠道菌群主要由细菌组成，作者评估了真菌和细菌之间的相互作用。与健康受试者相比，本文在CRC中发现了31种差异丰度的细菌（称为“细菌核心组”），包括致病性F nucleatum、Parvimonas micra和Gemella morbillorum的富集，以及益生菌Roseburia intestinalis、Bifidobacterium bifidum和Streptococcus thermophilus的消耗。然后作者评估了真菌和细菌的跨界相互作用，观察到从健康受试者组（n=143）、腺瘤患者组（n=156）到CRC患者组（n=184）的真菌-细菌相互作用的数量显著增加。同样的，真菌-细菌相互作用随着CRC进展而增强（图5A）。共有99种真菌-细菌相互作用，包括A rambellii和F nucleatum之间的相关性，仅在CRC患者中显著，而在腺瘤患者和健康受试者中不显著（图5B），而有17种真菌-细菌的相互作用，包括A rambellii和P micra的相关性，在CRC和腺瘤中均显著。

　　

　　图5. CRC进展中的真菌-真菌和真菌-细菌相互作用

　　6. 肠道真菌和细菌的相互作用与CRC进展相关

　　通过比较CRC患者与健康受试者的相关性强度，本文进一步研究了微生物之间的相互作用与CRC进展的相关性。真菌-真菌相互作用网络（z score=+4）与细菌-细菌网络（z score=-2）不同。在健康受试者中观察到更多正的真菌-真菌差异相关性（占总真菌-真菌差异相关性的30.77%），随着CRC进展而下降。相反大多数真菌-细菌差异相关在CRC中为正相关（占真菌-细菌总差异相关的56.72%），但在健康受试者中不显著。

　　为了可视化差异相互作用网络，使用差异基因相关分析，将具有相似的差异相关强度（z分数）的微生物按亲和传播簇分组。核心组的33种真菌和31种细菌被分为6组（图6）。这6组中有2组显示出优势；分别命名为FunCluster（81.8%的微生物是真菌）和Bac_cluster（81.0%的微生物是细菌）。这两个大组也暗示了CRC进展中的真菌-真菌和细菌-细菌间相互作用的差异。

　　

　　图6. CRC患者和健康受试者间的差异相关网络

　　7. 组合的真菌和细菌生物标志物panel可提高CRC的诊断性能

　　为了提高CRC的诊断性能，本文使用真菌和细菌组合的生物标志物panel。作者分别使用17种真菌、12种细菌和混合的5种真菌加9种细菌对CRC诊断panel进行训练（图7A）。在2个队列（2016_VogtmannE和2019_WirbelJ）中，纯真菌组在CRC诊断中的性能优于纯细菌组。然后，作者将来自8个队列的所有样本合并在一起，通过5倍交叉验证的随机森林评估生物标志物panel将CRC患者与健康受试者区分的整体性能（图7B）。真菌和细菌组合panel的AUC达到90.02%，纯细菌组AUC为83.22%。真菌和细菌组合panel的性能明显改善，在8个队列中有5个队列的AUC>80%，与纯细菌panel相比AUC提高1.44%-10.60%（图7C）。

　　真菌和细菌组合的panel也可以将早期CRC患者（AUC=73.85%–89.85%）或晚期CRC患者（AUC=80.76%–90.86%）与健康受试者区分开来。此外，组合panel可以将CRC患者与腺瘤患者进行分类（AUC=86.39%），其性能优于纯细菌panel（AUC=82.95%）。

　　

　　图7. 组合真菌和细菌物种的生物标志物panel提高CRC诊断性能

　　讨论

　　检测粪便中微生物的丰度的侵入性，低于传统结直肠恶性肿瘤的内窥镜筛查，在世界范围内得到越来越多的认可。然而，由于不同人群肠道菌群的高度异质性，因此在群体水平上识别特征微生物一直具有挑战性。在本研究中，多队列分析表明真菌和细菌生物标记物的联合使用可以进一步提升诊断性能，从而凸显肠道真菌在临床应用中的潜力。

　　结语

　　本文的meta分析阐明了肠道真菌菌群在CRC进展中的重要作用。作者鉴定了不同来源的CRC患者和腺瘤患者相关的特征性真菌并发现致病性真菌A rambellii在体外和体内显著促进了CRC的发展。因此，值得进行进一步的机制研究以表征菌群失衡的后果，并评估CRC中富集的真菌物种是否导致CRC。

　　本文的结果也强调了真菌作为CRC诊断生物标志物的潜力。有必要对真菌和细菌组合生物标志物的CRC诊断panel进行临床评估，这可能改善当前基于细菌物种生物标志物panel的性能。

　　END

　　参考文献： [1] Lin Y, Lau H C H, Liu Y, et al. Altered Mycobiota Signatures and Enriched Pathogenic Aspergillus rambellii Are Associated With Colorectal Cancer Based on Multicohort Fecal Metagenomic Analyses[J]. Gastroenterology, 2022.

　　撰写丨无言 编辑、排版丨SX